Javascript er for øyeblikket deaktivert i nettleseren din.Når javascript er deaktivert, vil enkelte funksjoner på denne nettsiden ikke fungere.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Spania * Disse forfatterne har litt innsikt i dette verket Equal bidragsbakgrunn: Hyaluronsyre (HA) er et naturlig forekommende polysakkarid som brukes i produksjon av hudfyllstoffer for estetiske formål.Siden det har en halveringstid på flere dager i menneskelig vev, er HA-baserte dermale fyllstoffer kjemisk modifisert for å forlenge levetiden i kroppen.Den vanligste modifikasjonen i kommersielle HA-baserte fyllstoffer er bruken av 1,4-butandiol-diglycidyleter (BDDE) som et tverrbindingsmiddel for å tverrbinde HA-kjedene.Resterende eller ureagert BDDE anses som ikke-giftig ved <2 deler per million (ppm);derfor må gjenværende BDDE i det endelige dermale fyllstoffet kvantifiseres for å sikre pasientsikkerhet.Materialer og metoder: Denne studien beskriver påvisning og karakterisering av et biprodukt av tverrbindingsreaksjonen mellom BDDE og HA under alkaliske forhold ved å kombinere væskekromatografi og massespektrometri (LC-MS).Resultater: Etter forskjellige analyser ble det funnet at de alkaliske forholdene og den høye temperaturen som ble brukt til å desinfisere HA-BDDE-hydrogelen fremmet dannelsen av dette nye biproduktet, den "propylenglykol-lignende" forbindelsen.LC-MS-analyse bekreftet at biproduktet har samme monoisotopiske masse som BDDE, en annen retensjonstid (tR) og en annen UV-absorbans (λ=200 nm) modus.I motsetning til BDDE, ble det observert i LC-MS-analyse at under de samme måleforholdene har dette biproduktet en høyere deteksjonshastighet ved 200 nm.Konklusjon: Disse resultatene indikerer at det ikke er noe epoksid i strukturen til denne nye forbindelsen.Diskusjonen er åpen for å vurdere risikoen for dette nye biproduktet som finnes i produksjonen av HA-BDDE hydrogel (HA dermal filler) for kommersielle formål.Nøkkelord: hyaluronsyre, HA dermal filler, kryssbundet hyaluronsyre, BDDE, LC-MS analyse, BDDE biprodukt.
Fyllstoffer basert på hyaluronsyre (HA) er de vanligste og mest populære hudfyllstoffene som brukes til kosmetiske formål.1 Dette dermale fyllstoffet er en hydrogel, vanligvis sammensatt av >95% vann og 0,5-3% HA, noe som gir dem en gellignende struktur.2 HA er et polysakkarid og hovedkomponenten i den ekstracellulære matrisen til virveldyr.En av ingrediensene.Den består av (1,4)-glukuronsyre-β (1,3)-N-acetylglukosamin (GlcNAc) repeterende disakkaridenheter forbundet med glykosidbindinger.Dette disakkaridmønsteret er det samme i alle organismer.Sammenlignet med noen proteinbaserte fyllstoffer (som kollagen), gjør denne egenskapen HA til et svært biokompatibelt molekyl.Disse fyllstoffene kan vise aminosyresekvensspesifisitet som kan gjenkjennes av pasientens immunsystem.
Når det brukes som et hudfyllstoff, er hovedbegrensningen for HA dens raske omsetning i vevet på grunn av tilstedeværelsen av en spesifikk familie av enzymer kalt hyaluronidaser.Så langt har flere kjemiske modifikasjoner i HA-strukturen blitt beskrevet for å øke halveringstiden til HA i vev.3 De fleste av disse modifikasjonene forsøker å redusere tilgangen til hyaluronidase til polysakkaridpolymerer ved å tverrbinde HA-kjeder.Derfor, på grunn av dannelsen av broer og de intermolekylære kovalente bindingene mellom HA-strukturen og tverrbindingsmidlet, produserer den tverrbundne HA-hydrogelen flere anti-enzymnedbrytningsprodukter enn den naturlige HA.4-6
Så langt inkluderer de kjemiske tverrbindingsmidlene som brukes til å produsere tverrbundet HA metakrylamid, 7 hydrazid, 8 karbodiimid, 9 divinylsulfon, 1,4-butandioldiglycidyleter (BDDE) og poly(etylenglykol)diglycidyleter.10,11 BDDE er for tiden det mest brukte tverrbindingsmidlet.Selv om disse typer hydrogeler har vist seg å være trygge i flere tiår, er tverrbindingsmidlene som brukes, reaktive reagenser som kan være cytotoksiske og i noen tilfeller mutagene.12 Derfor må restinnholdet i den endelige hydrogelen være høyt.BDDE anses som trygt når restkonsentrasjonen er mindre enn 2 deler per million (ppm).4
Det er flere metoder for å oppdage lav-rest BDDE-konsentrasjon, kryssbindingsgrad og substitusjonsposisjon i HA-hydrogeler, for eksempel gasskromatografi, størrelseseksklusjonskromatografi kombinert med massespektrometri (MS), kjernemagnetisk resonans (NMR) fluorescensmålingsmetoder, og Diodearray-koblet høyytelses væskekromatografi (HPLC).13-17 Denne studien beskriver påvisning og karakterisering av et biprodukt i den endelige tverrbundne HA-hydrogelen produsert ved omsetning av BDDE og HA under alkaliske forhold.HPLC og væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS analyse).Siden toksisiteten til dette biproduktet av BDDE er ukjent, anbefaler vi at dets restkvantifisering bestemmes på samme måte som metoden som vanligvis utføres på BDDE i sluttproduktet.
Det oppnådde natriumsaltet av HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) har en molekylvekt på ~1 368 000 Da (Laurent-metoden) 18 og en egenviskositet på 2,20 m3/kg.For tverrbindingsreaksjonen ble BDDE (≥95%) kjøpt fra Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).Fosfatbufret saltvann med pH 7,4 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Company.Alle løsningsmidler, acetonitril og vann som ble brukt i LC-MS-analysen ble kjøpt fra HPLC-kvalitet.Maursyre (98%) kjøpes som reagenskvalitet.
Alle eksperimenter ble utført på et UPLC Acquity-system (Waters, Milford, MA, USA) og koblet til et API 3000 trippelt kvadrupol massespektrometer utstyrt med en elektrospray-ioniseringskilde (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
Syntesen av tverrbundne HA-hydrogeler ble startet ved å tilsette 198 mg BDDE til en 10 % (vekt/vekt) natriumhyaluronat-løsning (NaHA) i nærvær av 1 % alkali (natriumhydroksid, NaOH).Den endelige BDDE-konsentrasjonen i reaksjonsblandingen var 9,9 mg/ml (0,049 mM).Deretter ble reaksjonsblandingen grundig blandet og homogenisert og fikk fortsette ved 45°C i 4 timer.19 pH i reaksjonen holdes på ~12.
Deretter ble reaksjonsblandingen vasket med vann, og den endelige HA-BDDE-hydrogelen ble filtrert og fortynnet med PBS-buffer for å oppnå en HA-konsentrasjon på 10 til 25 mg/ml, og en endelig pH på 7,4.For å sterilisere de produserte tverrbundne HA-hydrogelene autoklaveres alle disse hydrogelene (120°C i 20 minutter).Den rensede BDDE-HA-hydrogelen lagres ved 4°C inntil analyse.
For å analysere BDDE tilstede i det tverrbundne HA-produktet, ble en 240 mg prøve veid og innført i senterhullet (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; volum 0,5 ml) og sentrifugert ved 10 000 rpm ved romtemperatur 10 minutter.Totalt 20 µL nedtrekksvæske ble samlet og analysert.
For å analysere BDDE-standarden (Sigma-Aldrich Co) under alkaliske forhold (1 %, 0,1 % og 0,01 % NaOH), hvis følgende betingelser er oppfylt, er væskeprøven 1:10, 1:100, eller opp til 1:1 000 000 Bruk om nødvendig MilliQ avionisert vann for analyse.
For utgangsmaterialene som ble brukt i tverrbindingsreaksjonen (HA 2%, H2O, 1% NaOH og 0,049 mM BDDE), ble 1 ml av hver prøve fremstilt fra disse materialene analysert ved bruk av de samme analysebetingelsene.
For å bestemme spesifisiteten til toppene som vises i ionekartet, ble 10 µL 100 ppb BDDE-standardløsning (Sigma-Aldrich Co) tilsatt til 20 µL prøven.I dette tilfellet er den endelige konsentrasjonen av standarden i hver prøve 37 ppb.
Forbered først en BDDE-stamløsning med en konsentrasjon på 11 000 mg/L (11 000 ppm) ved å fortynne 10 μL standard BDDE (Sigma-Aldrich Co) med 990 μL MilliQ vann (tetthet 1,1 g/mL).Bruk denne løsningen til å tilberede en 110 µg/L (110 ppb) BDDE-løsning som en mellomliggende standardfortynning.Bruk deretter den mellomliggende BDDE-standardfortynningsvæsken (110 ppb) for å forberede standardkurven ved å fortynne den mellomliggende fortynningsvæsken flere ganger for å oppnå ønsket konsentrasjon på 75, 50, 25, 10 og 1 ppb.Som vist i figur 1, er det funnet at BDDE-standardkurven fra 1,1 til 110 ppb har god linearitet (R2>0,99).Standardkurven ble gjentatt i fire uavhengige eksperimenter.
Figur 1 BDDE standard kalibreringskurve oppnådd ved LC-MS analyse, hvor en god korrelasjon er observert (R2>0,99).
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidyleter;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri.
For å identifisere og kvantifisere BDDE-standardene som er tilstede i den tverrbundne HA- og BDDE-standardene i basisløsningen, ble LC-MS-analyse brukt.
Den kromatografiske separasjonen ble oppnådd på en LUNA 2,5 µm C18(2)-HST-kolonne (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) og holdt ved romtemperatur (25°C) under analysen.Den mobile fasen består av acetonitril (løsningsmiddel A) og vann (løsningsmiddel B) som inneholder 0,1 % maursyre.Den mobile fasen elueres ved gradienteluering.Gradienten er som følger: 0 minutter, 2% A;1 minutt, 2% A;6 minutter, 98% A;7 minutter, 98% A;7,1 minutter, 2% A;10 minutter, 2 % A. Kjøretiden er 10 minutter og injeksjonsvolumet er 20 µL.Retensjonstiden for BDDE er ca. 3,48 minutter (fra 3,43 til 4,14 minutter basert på eksperimenter).Den mobile fasen ble pumpet med en strømningshastighet på 0,25 ml/min for LC-MS-analyse.
For BDDE-analyse og kvantifisering av MS, er UPLC-systemet (Waters) kombinert med et API 3000 trippel quadrupol massespektrometer (AB SCIEX) utstyrt med en elektrospray-ioniseringskilde, og analysen utføres i positiv ion-modus (ESI+).
I henhold til ionefragmentanalysen utført på BDDE, ble fragmentet med høyest intensitet bestemt til å være fragmentet tilsvarende 129,1 Da (Figur 6).Derfor, i multi-ion overvåkingsmodus (MIM) for kvantifisering, er massekonverteringen (masse-til-lading-forhold [m/z]) til BDDE 203,3/129,1 Da.Den bruker også full skanning (FS)-modus og produktionskanning (PIS)-modus for LC-MS-analyse.
For å verifisere spesifisiteten til metoden ble en blindprøve (initial mobil fase) analysert.Det ble ikke påvist noe signal i blankprøven med en massekonvertering på 203,3/129,1 Da.Når det gjelder repeterbarheten til eksperimentet, ble 10 standardinjeksjoner på 55 ppb (midt på kalibreringskurven) analysert, noe som resulterte i et gjenværende standardavvik (RSD) <5 % (data ikke vist).
Det gjenværende BDDE-innholdet ble kvantifisert i åtte forskjellige autoklaverte BDDE-tverrbundne HA-hydrogeler, tilsvarende fire uavhengige eksperimenter.Som beskrevet i "Materialer og metoder"-delen, blir kvantifiseringen evaluert av gjennomsnittsverdien av regresjonskurven til BDDE-standardfortynningen, som tilsvarer den unike toppen detektert ved BDDE-masseovergangen på 203,3/129,1 Da, med en retensjon tid på 3,43 til 4,14 minutter Venter ikke.Figur 2 viser et eksempelkromatogram av 10 ppb BDDE-referansestandarden.Tabell 1 oppsummerer gjenværende BDDE-innhold av åtte forskjellige hydrogeler.Verdiområdet er 1 til 2,46 ppb.Derfor er gjenværende BDDE-konsentrasjon i prøven akseptabel for human bruk (<2 ppm).
Figur 2 Ionekromatogram av 10 ppb BDDE-referansestandard (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z)-overgang oppnådd ved LC-MS-analyse av 203.30/129.10 Da (i positiv MRM-modus).
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidyleter;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, overvåking av flere reaksjoner;MS, masse;m/z, masse-til-ladning-forhold.
Merk: Prøver 1-8 er autoklaverte BDDE-tverrbundne HA-hydrogeler.Den gjenværende mengden BDDE i hydrogelen og toppen av BDDE-retensjonstid er også rapportert.Til slutt rapporteres også om eksistensen av nye topper med ulike retensjonstider.
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidyleter;HA, hyaluronsyre;MRM, overvåking av flere reaksjoner;tR, retensjonstid;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;RRT, relativ retensjonstid.
Overraskende nok viste analysen av LC-MS ionekromatogrammet at basert på alle de autoklaverte tverrbundne HA-hydrogelprøvene som ble analysert, var det en ekstra topp ved den kortere retensjonstiden på 2,73 til 3,29 minutter.For eksempel viser figur 3 ionekromatogrammet til en tverrbundet HA-prøve, der en ekstra topp vises ved en annen retensjonstid på omtrent 2,71 minutter.Den observerte relative retensjonstiden (RRT) mellom den nylig observerte toppen og toppen fra BDDE ble funnet å være 0,79 (tabell 1).Siden vi vet at den nylig observerte toppen er mindre beholdt i C18-kolonnen brukt i LC-MS-analysen, kan den nye toppen tilsvare en mer polar forbindelse enn BDDE.
Figur 3 Ionekromatogram av tverrbundet HA-hydrogelprøve oppnådd ved LC-MS (MRM-massekonvertering 203,3/129,0 Da).
Forkortelser: HA, hyaluronsyre;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, overvåking av flere reaksjoner;RRT, relativ retensjonstid;tR, retensjonstid.
For å utelukke muligheten for at de nye toppene som ble observert kan være forurensninger som opprinnelig var tilstede i råvarene som ble brukt, ble disse råvarene også analysert med samme LC-MS analysemetode.Utgangsmaterialene som ble analysert inkluderer vann, 2% NaHA i vann, 1% NaOH i vann og BDDE i samme konsentrasjon som ble brukt i tverrbindingsreaksjonen.Ionekromatogrammet til utgangsmaterialet som ble brukt viste ingen forbindelse eller topp, og dets retensjonstid tilsvarer den nye observerte toppen.Dette faktum forkaster ideen om at ikke bare utgangsmaterialet kan inneholde forbindelser eller stoffer som kan forstyrre analyseprosedyren, men det er ingen tegn til mulig krysskontaminering med andre laboratorieprodukter.Konsentrasjonsverdiene oppnådd etter LC-MS-analyse av BDDE og nye topper er vist i tabell 2 (prøver 1-4) og ionekromatogrammet i figur 4.
Merk: Prøve 1-4 tilsvarer råvarene som brukes til å produsere autoklaverte BDDE-tverrbundne HA-hydrogeler.Disse prøvene ble ikke autoklavert.
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidyleter;HA, hyaluronsyre;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, overvåking av flere reaksjoner.
Figur 4 tilsvarer LC-MS-kromatogrammet til en prøve av råmaterialet som brukes i tverrbindingsreaksjonen av HA og BDDE.
Merk: Alle disse måles ved samme konsentrasjon og forhold som brukes til å utføre tverrbindingsreaksjonen.Tallene for råvarene analysert med kromatogrammet tilsvarer: (1) vann, (2) 2 % HA vandig løsning, (3) 1 % NaOH vandig løsning.LC-MS-analyse utføres for massekonvertering på 203.30/129.10 Da (i positiv MRM-modus).
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidyleter;HA, hyaluronsyre;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, overvåking av flere reaksjoner.
Forholdene som førte til dannelsen av nye topper ble studert.For å studere hvordan reaksjonsbetingelsene som brukes til å produsere den tverrbundne HA-hydrogelen påvirker reaktiviteten til BDDE-tverrbindingsmidlet, som fører til dannelse av nye topper (mulige biprodukter), ble det utført forskjellige målinger.I disse bestemmelsene studerte og analyserte vi den endelige BDDE-tverrbinderen, som ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av NaOH (0%, 1%, 0,1% og 0,01%) i et vandig medium, etterfulgt av eller uten autoklavering.Bakterieprosedyren for å simulere de samme forholdene er den samme som metoden som brukes til å produsere den tverrbundne HA-hydrogelen.Som beskrevet i delen "Materialer og metoder", ble masseovergangen til prøven analysert av LC-MS til 203.30/129.10 Da.BDDE og konsentrasjonen av den nye toppen er beregnet, og resultatene er vist i tabell 3. Det ble ikke påvist nye topper i prøvene som ikke ble autoklavert, uavhengig av tilstedeværelsen av NaOH i løsningen (prøve 1-4, tabell 3).For autoklaverte prøver påvises nye topper kun i nærvær av NaOH i løsningen, og dannelsen av toppen ser ut til å avhenge av NaOH-konsentrasjonen i løsningen (prøver 5-8, tabell 3) (RRT = 0,79).Figur 5 viser et eksempel på et ionekromatogram, som viser to autoklaverte prøver i nærvær eller fravær av NAOH.
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidyleter;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, overvåking av flere reaksjoner.
Merk: Det øverste kromatogrammet: Prøven ble behandlet med 0,1 % vandig NaOH-løsning og autoklaveret (120°C i 20 minutter).Bunnkromatogram: Prøven ble ikke behandlet med NaOH, men autoklaveret under samme forhold.Masseomdannelsen på 203,30/129,10 Da (i positiv MRM-modus) ble analysert med LC-MS.
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidyleter;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, overvåking av flere reaksjoner.
I alle autoklaverte prøver, med eller uten NaOH, ble BDDE-konsentrasjonen kraftig redusert (opptil 16,6 ganger) (prøver 5-8, tabell 2).Nedgangen i BDDE-konsentrasjon kan skyldes det faktum at ved høye temperaturer kan vann fungere som en base (nukleofil) for å åpne epoksidringen til BDDE for å danne en 1,2-diolforbindelse.Den monoisotopiske kvaliteten til denne forbindelsen er forskjellig fra den til BDDE og vil derfor ikke bli påvirket.LC-MS oppdaget et masseskift på 203.30/129.10 Da.
Til slutt viser disse eksperimentene at genereringen av nye topper avhenger av tilstedeværelsen av BDDE, NAOH og autoklaveringsprosessen, men har ingenting med HA å gjøre.
Den nye toppen funnet ved en retensjonstid på ca. 2,71 minutter ble deretter karakterisert ved LC-MS.For dette formål ble BDDE (9,9 mg/ml) inkubert i en 1% vandig NaOH-løsning og autoklaveret.I tabell 4 er egenskapene til den nye toppen sammenlignet med den kjente BDDE-referansetoppen (retensjonstid ca. 3,47 minutter).Basert på ionefragmenteringsanalysen av de to toppene kan det konkluderes med at toppen med en retensjonstid på 2,72 minutter viser de samme fragmentene som BDDE-toppen, men med ulik intensitet (Figur 6).For toppen som tilsvarer retensjonstiden (PIS) på 2,72 minutter, ble det observert en mer intens topp etter fragmentering ved en masse på 147 Da.Ved BDDE-konsentrasjonen (9,9 mg/ml) som ble brukt i denne bestemmelsen, ble forskjellige absorbansmodi (UV, λ=200 nm) i det ultrafiolette spekteret også observert etter kromatografisk separasjon (figur 7).Toppen med en retensjonstid på 2,71 minutter er fortsatt synlig ved 200 nm, mens BDDE-toppen ikke kan observeres i kromatogrammet under samme forhold.
Tabell 4 Karakteriseringsresultater av den nye toppen med en retensjonstid på ca. 2,71 minutter og BDDE-toppen med en retensjonstid på 3,47 minutter
Merk: For å oppnå disse resultatene ble LC-MS og HPLC analyser (MRM og PIS) utført på de to toppene.For HPLC-analyse brukes UV-deteksjon med en bølgelengde på 200 nm.
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidyleter;HPLC, høyytelses væskekromatografi;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, overvåking av flere reaksjoner;m/z, masse-til-ladning-forhold;PIS, produkt Ion skanning;ultrafiolett lys, ultrafiolett lys.
Merk: Massefragmentene er oppnådd ved LC-MS-analyse (PIS).Toppkromatogram: massespektrum av BDDE-standardprøvefragmenter.Bunnkromatogram: Massespekteret til den nye toppen detektert (RRT assosiert med BDDE-toppen er 0,79).BDDE ble behandlet i 1 % NaOH-løsning og autoklaveret.
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidyleter;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, overvåking av flere reaksjoner;PIS, produkt ion skanning;RRT, relativ retensjonstid.
Figur 7 Ionekromatogram av 203,30 Da-forløperionet, og (A) den nye toppen med en retensjonstid på 2,71 minutter og (B) UV-deteksjonen av BDDE-referansestandardtoppen ved 3,46 minutter ved 200 nm.
I alle de tverrbundne HA-hydrogelene som ble produsert, ble det observert at den gjenværende BDDE-konsentrasjonen etter LC-MS-kvantifisering var <2 ppm, men en ny ukjent topp dukket opp i analysen.Denne nye toppen samsvarer ikke med BDDE-standardproduktet.BDDE-standardproduktet har også gjennomgått den samme kvalitetskonverteringsanalysen (MRM-konvertering 203.30/129.10 Da) i positiv MRM-modus.Vanligvis brukes andre analytiske metoder som kromatografi som grensetester for å påvise BDDE i hydrogeler, men den maksimale deteksjonsgrensen (LOD) er litt lavere enn 2 ppm.På den annen side, så langt, har NMR og MS blitt brukt for å karakterisere graden av tverrbinding og/eller modifikasjon av HA i sukkerenhetsfragmentene til tverrbundne HA-produkter.Hensikten med disse teknikkene har aldri vært å kvantifisere gjenværende BDDE-deteksjon ved så lave konsentrasjoner som vi beskriver i denne artikkelen (LOD av vår LC-MS-metode = 10 ppb).
Innleggstid: Sep-01-2021